Obiekt
Tytuł: Modyfikowany układ laktoperoksydazowy jako czynnik ograniczający rozwój kariogennego biofilmu Streptococcus mutans
Abstrakt:
Wstęp Układ laktoperoksydazowy jest niespecyficznym i niekomórkowym elementem układu odpornościowego działającego w wydzielinach ustroju takich jak ślina, łzy, wydzielina dróg oddechowych, mleko czy wydzielina żeńskiego układu rozrodczego. Układ ten pełni istotną rolę w obronie przeciwdrobnoustrojowej w obrębie błon śluzowych organizmu. W skład tego układu wchodzą laktoperoksydaza (LPO) – enzym o charakterze hemoproteiny, substraty LPO (nadtlenek wodoru oraz (pseudo)halogenki) oraz produkty enzymatycznego utleniania (pseudo)halogenków w tak zwanym cyklu (pseudo)halogenacji. Głównym substratem in vivo układu LPO są jony tiocyjanianowe (SCN-) utleniane przez enzym do hypotiocyjanianu (HOSCN/OSCN-). Działanie przeciwdrobnoustrojowe hypotiocyjanianu związane jest ze zdolnością do utleniania grup sulfhydrylowych białek drobnoustrojów doprowadzając w ten sposób do utraty ich biologicznej aktywności. Niestety wyniki opublikowanych badań wskazują na fakt, iż o ile układ LPO wykazuje znaczące działanie przeciwdrobnoustrojowe wobec drobnoustrojów planktonicznych o tyle jego działanie przeciwbiofilmowe czy przeciwdrobnoustrojowe wobec drobnoustrojów tworzących biofilmy jest znacznie osłabione czy wręcz nieistotne statystycznie. Należy zwrócić uwagę, iż laktoperoksydaza posiada zdolność również do utleniania innych (pseudo)halogenków nieobecnych fizjologicznie w płynach ustrojowych bądź ob ; ecnych w nieistotnie niskich stężeniach do produktów o znacznie silniejszym potencjale oksydacyjnym od produktu fizjologicznego. Przykładowymi alternatywnymi substratami (pseudo)halogenkowymi są jodki utleniane do różnych reaktywnych form jodu (w zależności od warunków środowiskowych), selenocyjaniany utleniane do hyposelenocyjanianu oraz mieszanina tiocyjanianów i jodków, która w wyniku reakcji enzymatycznej oraz reakcji następczych utleniana jest do wysoce toksycznego jodocyjanu. Wskazane produkty z racji na swoją znacznie większą reaktywność potencjalnie mogą charakteryzować się również silniejszym działaniem przeciwbiofilmowym. Laktoperoksydaza podobnie jak inne peroksydazy wykazuje również zdolność do utleniania związków organicznych w tak zwanym cyklu peroksydacji. Substratami tego cyklu jest nadtlenek wodoru oraz duża liczba związków organicznych o charakterze fenoli (proste związki fenolowe w tym polifenole, peptydy, białka, leki). Z punktu widzenia obrony przeciwdrobnoustrojowej wchodzenie w cykl peroksydacji jest niekorzystne. Związane jest to po pierwsze ze zużywaniem nadtlenku wodoru (którego ilość in vivo jest ograniczona) na potrzeby nieefektywnego w kontekście działania bójczego cyklu peroksydacji. Po drugie cykl peroksydacji składa się z dwóch następujących po sobie reakcji utleniania cząsteczki organicznej, gdzie po pierwszym utlenianiu cząsteczka enzymu tworzy ; tak zwany Compound II będący wysoce stabilną i słabo reaktywną formą enzymu. Compound II jest zdolny do stosunkowo wolnej reakcji tylko z niektórymi substratami organicznymi a jego nagromadzenie powoduje zmniejszenie puli enzymu potencjalnie zdolnego do syntezy produktów przeciwdrobnoustrojowych. Zjawisko nagromadzania się Compound II ma miejsce w sytuacji wzmożonej dostępności nadtlenku wodoru w przebiegu reakcji zapalnych co ma konsekwencje w osłabieniu działania przeciwdrobnoustrojowego układu w sytuacji, w której to działanie jest szczególnie potrzebne. Cel badań Celem przeprowadzonych badań była próba odpowiedzi na pytanie czy jest możliwość wzmożenia działania przeciwbiofilmowego układu laktoperoksydazowego poprzez jego modyfikację dzięki 1) zastosowaniu niefizjologicznych substratów (pseudo)halogenkowych oraz 2) zwiększeniu szybkości reakcji syntezy produktów przeciwdrobnoustrojowych dzięki zastosowaniu reaktywatorów (pochodzących z kłącza Reynoutria japonica, R. sachalinensis oraz R. x bohemica) wysoce stabilnej i nieaktywnej formy Compound II. Metody W celu odpowiedzi na wyżej postawione pytanie badawcze posłużono się dalej wymienionymi metodami. We wszystkich eksperymentach posłużono się preparatem laktoperoksydazy mleka krowiego o wysokiej czystości. W badaniach mających na celu ocenę możliwości aktywacji układu laktoperoksydazowego w celu zwiększenia szybkości synt ; ezy produktu przeciwdrobnoustrojowego posłużono się: 1) kinetycznymi spektrofotometrycznymi pomiarami szybkości utleniania odczynnika Ellmana w celu oceny działania reaktywacyjnego ekstraktów oraz frakcji ekstraktów z kłączy trzech gatunków z rodzaju Reynoutria oraz czterech związków polifenolowych będących przedstawicielami głównych grup polifenoli zidentyfikowanych w materiale roślinnym. 2) spektroskopią zatrzymanego przepływu UV/VIS w celu oceny mechanizmu działania aktywacyjnego/inhibicyjnego badanych ekstraktów / frakcji / związków, 3) kinetycznym monitorowaniem w czasie gęstości optycznej hodowli Streptococcus mutans z dodatkiem układu laktoperoksydazowego oraz poszczególnych badanych ekstraktów / frakcji / polifenoli; 4) oceną MIC i MBC poszczególnych badanych substancji w celu wykluczenia przeciwdrobnoustrojowego działania samych tych substancji co w konsekwencji stanowi potwierdzenie działania aktywacyjnego tych substancji wobec układu laktoperoksydazowego. W badaniach mających na celu ocenę działania przeciwbiofilmowego układu laktoperoksydazowego zmodyfikowanego o zastosowanie niefizjologicznych substratów (pseudo)halogenkowych posłużono się modelem biofilmu kariogennego Streptococcus mutans hodowanego w dołkach płytek polistyrenowych w środowisku o dużej dostępności sacharozy. W celu oceny działania przeciwbiofilmowego posłużono się następującymi metodami: 5) pomiar ; całkowitej biomasy biofilmu metodą z fioletem krystalicznym; 6) pomiar masy nierozpuszczalnego polisacharydu metodą antronową; 7) kinetyczny bioamperometryczny pomiar stężenia mleczanu, glukozy oraz sacharozy w mediach hodowlanych znad biofilmu; 8) pomiar aktywności układu fosfotransferaz odpowiedzialnego za dokomórkowy transfer węglowodanów; 9) pomiar stężenia NAD+ i NADH w biofilmach metodą elektroforezy kapilarnej. W celu oceny toksyczności in vitro badanych modyfikacji układ laktoperksydazowego, posłużono się modelem hodowli adherentnej ludzkich pierwotnych fibroblastów dziąseł. Toksyczność oceniano przy użyciu następujących technik: 10) ocena działania proapoptotycznego – analiza cytometryczna z użyciem aneksyny V skoniugowanej z barwnikiem fluorescencyjnym; 11) ocena wpływu na cykl komórkowy – analiza cytometryczna komórek barwionych jodkiem propidyny po trawieniu wewnątrzkomórkowego RNA; 12) ocena wpływu na wewnątrzkomórkowe zapasy glutationu – analiza cytometryczna z zastosowaniem fluorescencyjnej sondy wiążącej glutation; ocena wpływu na powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego – analiza cytometryczna komórek barwionych przy pomocy barwnika MitoSOX. Wyniki W wyniku przeprowadzonej oceny działania ekstraktów z Reynoutria sp. i ich frakcji jak i czystych polifenoli dowiedziono, iż: 1) związki o charakterze polifenoli mogą być zarówno aktywatorami jak i inhibitorami cyk ; lu (pseudo)halogenacji laktoperoksydazy. 2) Najsilniejsze działanie aktywacyjne wykazywały frakcje dichlorometanowa oraz eterowa ekstraktu z R. x bohemica a w przypadku czystych polifenoli, działanie aktywacyjne wykazywała (-)epikatechina. 3) Obserwowane działanie aktywacyjne było związane ze zdolnością do szybkiego reagowania polifenoli z formą Compound II enzymu przywracając enzym do wyjściowej reaktywnej formy natywnej. 4) Frakcje ekstraktów bogate w polifenole o dużej masie cząsteczkowej i o silnym stopniu usieciowania jak i przedstawiciel tych związków – wanikozyd B wykazywały zjawisko hamujące cykl (pseudo)halogenacji laktoperoksydazy. 5) Potwierdzono, że zjawisko aktywacji układu laktoperoksydazowgo zwiększa jego przeciwdrobnoustrojowe działanie wobec S. mutans. Przeprowadzone eksperymenty dotyczące ocen wpływu układu laktoperoksydazowego zmodyfikowanego przez zastosowanie różnych układów substratowych dowiodły że: 6) fizjologiczny układ laktoperoksydazowy, którego substratem (pseudo)halogenkowym jest tiocyjanian nie charakteryzuje się istotnym działaniem przeciwbofilmowym bądź hamującym działanie kariogenne biofilmów S. mutans. 7) Z kolei układ zmodyfikowany przez zastąpienie tiocyjaninów jodkami charakteryzował się najsilniejszym efektem przeciwbiofilmowym i przeciwkariogennym spośród badanych układów, wpływając na: zmniejszenie biomasy wytworzonego biofilmu, zmniejsze ; nie masy wytworzonego nierozpuszczalnego polisacharydu, upośledzenie transportu dokomórkowego węglowodanów, zahamowanie syntezy kwasu mlekowego, osłabienie intensywności przemian redoks objawiające się spadkiem stężenia wewnątrzkomórkowego NAD+ i NADH. 8) Układ syntezujący jodocyjan wbrew oczekiwaniom nie wykazywał istotnego działania przeciwbiofilmowego. 9) Układ zawierający jako substrat selenocyjanian wykazywał umiarkowane działanie przeciwbiofilmowe. W badaniach toksyczności in vitro układu laktoperoksydazowego modyfikowanego przez zastosowanie alternatywnych substratów dowiedziono iż: 11) każdy z badanych układów w tym układ fizjologiczny wykazywał statystycznie istotne działanie toksyczne. 12) Działanie to związane było z efektem zwiększenia przepuszczalności błon komórek poddanych inkubacji z badanymi układami. 13) Nie stwierdzono, aby obserwowane działanie toksyczne było związane ze zjawiskami nasilania stresu oksydacyjnego 14) Najsilniejsze działanie toksyczne zidentyfikowano w przypadku układu z jodkiem jako substratem (pseudo)halogenkowym . Wnioski Niniejsze badania sugerują, iż możliwe jest takie zmodyfikowanie układu LPO aby wykazywał on działanie nie tylko przeciwdrobnoustrojowe wobec drobnoustrojów planktonicznych ale również wobec biofilmów. Przedstawione badania jednoznacznie wskazują na potencjał laktoperoksydazy jako biocząsteczki o możliwym zastosowaniu w zw ; alczaniu biofilmów chorobotwórczych a w szczególności biofilmów powiązanych z powstawaniem próchnicy zębów.
Miejsce wydania:
Stopień studiów:
Instytucja nadająca tytuł:
Rada Dyscypliny Nauki medyczne
Promotor:
Data wydania:
Identyfikator:
Język:
Prawa dostępu:
Kolekcje, do których przypisany jest obiekt:
Data ostatniej modyfikacji:
17 lut 2025
Data dodania obiektu:
17 lut 2025
Liczba wyświetleń treści obiektu:
0
Liczba wyświetleń treści obiektu w formacie PDF
0
Wszystkie dostępne wersje tego obiektu:
http://dl.cm-uj.krakow.pl:8080/publication/5201
Wyświetl opis w formacie RDF:
Wyświetl opis w formacie OAI-PMH:
| Nazwa wydania | Data |
|---|---|
| UJCMa7232a9b5028414fb24ec6ae0d64634c | 17 lut 2025 |
Obiekty
Podobne
Magacz, Marcin
Pasich, Ewa
Ścibik, Łukasz
Hajto-Bryk, Justyna
Łoboda, Magdalena
Jankowska, Katarzyna
Głowacki, Roman
