Object
Title: Ocena ekspresji miRNA w osoczu oraz w tkance guza u chorych z rozpoznaniem biopsyjnym podejrzenie nowotworu pęcherzykowego tarczycy w poszukiwaniu biomarkerów różnicujących zmiany łagodne i złośliwe przed zabiegiem operacyjnym
Abstract:
Wprowadzenie Zmiany ogniskowe w tarczycy stwierdza się u około 65% badanych. W znakomitej większości są to zmiany łagodne. Według danych pochodzących z analiz przeprowadzonych na dużych grupach chorych odsetek nowotworów złośliwych waha się w przedziale 3%–15%. W ciągu ostatnich lat zapadalność na raka tarczycy dynamicznie wzrasta. Istotna rolę w algorytmie diagnostycznym stanowi biopsja aspiracyjna cienkoigłowa celowana (BACC). BACC charakteryzuje się dużą dokładnością i pozwala zakwalifikować zmianę ogniskową jako łagodną bądź złośliwą. W Polsce przyjęto klasyfikację cytologiczną bioptowanych zmian według systemu Bethesda (TBSRTC − The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology), który wyróżnia 6 kategorii, przypisując każdej określone ryzyko złośliwości. W rozprawie doktorskiej poddano analizie chorych z kategorią IV wg klasyfikacji Bethesda – podejrzenie nowotworu pęcherzykowego (SFN). Charakteryzuje się ona ryzykiem raka tarczycy wahającym się w przedziale 8,2-19%. Dotychczas nie wprowadzono do praktyki klinicznej testu, który wykazywałby dostatecznie wysoką czułość lub pozwalałby wykluczyć zmianę złośliwą, dlatego większość chorych z takim wynikiem BACC wymaga leczenia operacyjnego i weryfikacji histopatologicznej. Szansą na zwiększenie dokładności diagnostycznej okazały się badania molekularne. MiRNA należą do endogennych, jednoniciowych, niewi ; elkich, wysoce konserwatywnych, niekodujących cząsteczek, o długości 18 - 25 rybonukleotydów. Odgrywa istotną rolę w wielu zarówno w prawidłowym funkcjonowaniu komórek jak i procesach patologicznych, jak: proliferacja, różnicowanie oraz apoptoza. miRNA zaburza ekspresję genów na poziomie posttranskrypcyjnym poprzez interakcję z mRNA. Są bardzo trwałe I ich struktura pozostaje niezmieniona w tkankach po zamrożeniu oraz w formalinie. Ta właściwość pozwoliła podjąć próbę użycia miRNA w komercyjnych testach bazujących na diagnostyce molekularnej. Dotychczas opublikowano liczne prace, w których wykazano związek zaburzonej regulacji miRNA z nowotworami złośliwymi.Dotychczas opublikowano liczne prace, w których wykazano związek zaburzonej regulacji miRNA z nowotworami złośliwymi. W 2006 roku Weber i wsp. opublikowali pierwszą pracę na temat wykorzystania miRNA do różnicowania gruczolaka pęcherzykowego (FA) i raka pęcherzykowego tarczycy (FTC). Od tamtej pory w licznych pracach wykazano, że miRNA może być czułym biomarkerem raka tarczycy, zarówno w preparacie tkankowym, jak i w osoczu, przy czym większość publikacji dotyczy raka brodawkowatego. Cel Cel badania był dwojaki: scharakteryzowanie miRNA w zmianach ogniskowych tarczycy zweryfikowanych w BACC jako SFN oraz znalezienie w osoczu panelu miRNA, który pozwoliłby zróżnicować gruczolaka pęcherzykowego i dobrze zróżn ; icowane raki tarczycy (WDTC) – raka brodawkowatego i pęcherzykowego. Materiały i metody Do badania włączono 110 pacjentów operowanych w Oddziale Klinicznym Chirurgii Ogólnej z Onkologią Szpitala Miejskiego Specjalistycznego im. G. Narutowicza w Krakowie (na bazie którego działa III Katedra Chirurgii Ogólnej UJCM) w latach 2016–2020 z powodu podejrzenia nowotworu pęcherzykowego tarczycy. Kryteria włączenia stanowiły: potwierdzone cytologiczne rozpoznanie „podejrzenie nowotworu pęcherzykowego” lub „podejrzenie nowotworu z komórek Hürthle’a ” u chorego dotychczas nieleczonego z tego powodu, wiek od 18 do 90 r.ż., świadoma zgoda chorego na udział w badaniu. Z badania wyłączono chorych z obecnością typowych cech nowotworu złośliwego, takich jak naciekanie okolicznych tkanek, podejrzenie przerzutów do węzłów chłonnych lub przerzutów odległych stwierdzonych w badaniu klinicznym lub w przedoperacyjnych badaniach obrazowych. W pierwszej publikacji podjęto próbę wyodrębnienia czynników klinicznych lub ultrasonograficznych, które wiązałyby się z większym ryzykiem raka tarczycy. Grupy poddano analizie pod względem: wieku, płci, obecności choroby Hashimoto, średnicy guza, odsetka rozpoznań cytologicznych „podejrzenie z komórek Hürthle’a” oraz sumarycznej liczby klinicznych i ultrasonograficznych cech zwiększonego ryzyka złośliwości według rekomendacji Amerykańskiego Towarz ; ystwa Tyreologicznego (ATA). W drugiej pracy przeanalizowano wpływ elektywnej limfadenektomii przedziału VI szyi na pooperacyjny staging oraz wczesne powikłania pooperacyjne. Stopień zaawansowania choroby nowotworowej przedstawiono wg 8 edycji AJCC/ TNM z 2017 roku. Porównano odsetki wczesnych pooperacyjnych powikłań chirurgicznych w grupie badanej oraz w grupie chorych operowanych w tym samym okresie w tutejszej Klinice z powodu wola nienowotworowego. Ruchomość fałdów głosowych oceniał specjalista laryngologii w 2. dobie pooperacyjnej metodą wideolaryngoskopii. Odsetek uszkodzeń nerwów krtaniowych wstecznych (NKW) przedstawiono w przeliczeniu na nerwy narażone na ryzyko uszkodzenia, a nie na liczbę pacjentów. Za definicję hipokalcemii przyjęto obniżenie stężenia wapnia całkowitego w surowicy poniżej 2,0 mmol/l w okresie hospitalizacji. Opracowanie statystyczne wykonano w pakiecie oprogramowania Statistica 13 (StatSoft Inc). Do oceny normalności rozkładu zastosowano test zgodności Chi kwadrat. Jednoczynnikową analizę statystyczną materiału przeprowadzono przy pomocy testów Chi2 Pearsona dla zmiennych nominalnych oraz U Manna-Whitney'a i t-studenta dla zmiennych ilościowych. W ocenie istotności statystycznej przyjęto wartość p<0,05. Trzecia publikacja przedstawia analizę molekularną, którą przeprowadzono u 10 chorych z wysoko zróżnicowanym rakiem tarczycy (WDTC) ; oraz 14 chorych z gruczolakiem pęcherzykowym (FA) tarczycy. Obie grupy porównano pod kątem struktury płci, wieku, obecności choroby Hashimoto, średnicy guza oraz ultrasonograficznych czynników ryzyka jako punktacji w skali EU-TIRADS. Fragmenty guza oraz niezmienioną makroskopowo tkankę tarczycy zostały pobrane przez doświadczonego patologa, które zabezpieczono w RNA Later, a następnie umieszczono w temperature 80 st. C do momentu ekstrakcji RNA. Krew pobrano w sali operacyjnej przed nacięciem skóry. Około 50-100mg tkanki guza poddano lizie przy użyciu preaparatu TissueLyser LT (Qiagen, Hilden, Germany) i pobrano RNA. Z 0,5ml osocza wyizolowano całkowite RNA według protokołu RNAzol. Tak zwane małe RNA ( small RNA) zastosowano do przygotowania bibliotek NGS. W celu uzyskania RNA o wysokiej jakości usunięto z dalszej analizy odczyty zawierające poniżej 15 nukleotydów oraz nieposiadające adapterów. Po przygotowaniu bibliotek przeprowadzono sekwencjonowanie nowej generacji w aparacie NextSeq (llumina, San Diego, CA, USA). Uzyskane wyniki znormalizowano dostosowując je do rozmiarów bibliotek i przedstawiono jako liczbę odczytów na milion (CPM) wykorzystując oprogramowanie miRDeep2 software. Otrzymane odczyty miRNA zostały zachowane na lokalnym serwerze. Poddano ocenie jakość odczytów za pomocą oprogramowanie FastQC software. Tak opracowane znormalizowane wyniki – CPM ; s – zostały poddane skalowaniu wielowymiarowego. Do analizy statystycznej i eksploracyjnej miRNOME zastosowano pakiet LIMMA. Osoczowe miRNA wyizolowano z próbek o jednakowej objętości. Do analizyróżnicowej eskpresji miRNA zastosowano test t-studenta. Wyniki W pierwszej publikacji, która objęła 110 osób operowanych w powodu podejrzenia nowotworu pęcherzykowego tarczycy, w grupie chorych ze zmianą złośliwą stwierdzono, w porównaniu z grupą z gruczolakiem pęcherzykowym, przewagę mężczyzn (16,6% vs. 13,1%, p=0,31) większy odsetek biopsji zweryfikowanych jako podejrzenie nowotworu z komórek Hurthle’a (55,6%% vs. 45,7%, p=0,075), większy odsetek pacjentów z chorobą Hashimoto (33,3% vs. 31,5%, p=0,55), większy odsetek klinicznych i ultrasonograficznych cech zwiększonego ryzyka złośliwości (1,4 vs. 1,29, p=0,71), mniejszą średnicę guza (14,5 mm vs. 19,4 mm, p=0,15) oraz fakt, że chorzy byli średnio o 2,3 roku młodsi (53,1 vs. 55,4 roku, p=0,42). Wyniki te nie były istotne statystycznie W drugiej publikacji, w grupie 80 zoperowanych chorych, stwierdzono łącznie 129 węzłów chłonnych (średnio 1,6 węzła chłonnego na 1chorego) w preparacie pooperacyjnym, wszystkie węzły zostały zweryfikowane jako wolne od komórek nowotworowych. U 26 chorych nie znaleziono węzłów chłonnych w preparacie. W grupie chorych z rakiem tarczycy wykazano nieistotnie większą średnią liczbę węzłów chł ; onnych (2,2 vs. 1,5, p= 0,13) oraz nieistotnie częściej stwierdzano węzły chłonne w preparacie (90% vs. 64%, p=0,1). Analiza pooperacyjnych powikłań chirurgicznych nie wykazała istotnych różnic w częstości ich występowania pomiędzy grupą badaną a grupą kontrolną: niedowładu NKW (3,38% vs. 1,49%, p=0,08), krwawienia do rany pooperacyjnej (1,25% vs. 0,44%, p=0,29) oraz hipokalcemii (5% vs 5,4%, p= 0,86). Porównując częstość powikłań w zależności od zakresu zabiegu, wczesny pooperacyjny niedowład NKW oraz krwawienie do rany stwierdzono w grupie badanej jedynie u chorych poddanych całkowitemu wycięciu tarczycy. W ostatniej pracy przedstawiono wyniki badań molekularnych - różnicową ekspresję miRNA pomiędzy próbkami FA i WDTC. Stwierdzono znamienną statystycznie nadekspresję miRNA - miR-146b-5p (p=0,031) oraz miR-146b-3p (p= 0,034), natomiast poziom ekspresji miR-195-3p (p=0,032) okazał się istotnie niższy w grupie chorych z WDTC w porównaniu z grupą chorych z FA. Wyniki zostały zwalidowane przy wykorzystaniu zewnętrznej kohorty pochodzącej z The Cancer Genom Atlas (TCGA). Porównaniu z sygnatutrą z Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego uzyskano pokrycie 90% próbek (18 z 20 miRNAs). Następnie potwierdzono obecność miRNA w osoczu. Zmienność ekspresji zbadano za pomocą metody qPCR. W badaniu stwierdzono wyższy poziom ekspresji hsa_miR_195_u pacjentów z WDTC, co ; wskazuje na odwrotną zależność pomiędzy ekspresją tego miRNA w tkankach i osoczu w obu grupach ( WDTC vs FA). Uzyskany rezultat był istotny statystycznie (p =0,039). Wnioski W analizie czynników ryzyka nie stwierdzono wiarygodnych cech klinicznych, które charakteryzowałaby się znamiennie niskim ryzykiem raka w zmianach ogniskowych zweryfikowanych w BACC „podejrzenie nowotworu pęcherzykowego”, dlatego w guzach o średnicy przekraczającej 2cm leczenie operacyjne pozostaje najlepszą metodą pozwalającą wykluczyć złośliwy charakter zmiany. Poszerzenie zakresu o limfadenektomię przedziału VI szyi nie poprawia histopatologicznego stagingu, natomiast w doświadczonych ośrodkach w chirurgii tarczycy nie wiąże się z większym ryzykiem powikłań pooperacyjnych. MiRNA jest obiecującym biomarkerem różnicującym gruczolaka pęcherzykowego i dobrze zróżnicowane raki tarczycy. Zmienność ekspresji cząsteczek miRNA - miR-146b-5p oraz miR-146b-3p oraz miR-195-3p może być wykorzystana do odróżnienia zmiany łagodnej i złośliwej, natomiast miR-195-3p stanowi osoczowy biomarker, potencjalnie umożliwiający wykluczenie raka tarczycy na etapie przedoperacyjnym.
Place of publishing:
Level of degree:
Degree grantor:
Rada Dyscypliny Nauki medyczne
Promoter:
Date issued:
Identifier:
Call number:
Language:
Access rights:
Object collections:
Last modified:
Jul 4, 2024
In our library since:
May 22, 2024
Number of object content hits:
21
Number of object content views in PDF format
22
All available object's versions:
http://dl.cm-uj.krakow.pl:8080/publication/5113
Show description in RDF format:
Show description in OAI-PMH format:
| Edition name | Date |
|---|---|
| ZB-140348 | Jul 4, 2024 |
Objects
Similar
Świrta, Jarosław Szymon
Pawliński, Łukasz
Płatek, Teresa
Gacoń, Jacek
Salamon, Dominika
Sroka-Oleksiak, Agnieszka
