Object
Title: Biotechnologiczne metody otrzymywania fortyfikowanego mycelium modrzewnika lekarskiego w poszukiwaniu preparatów o działaniu profilaktycznym w chorobach cywilizacyjnych
Abstract:
Wstęp Postęp cywilizacyjny, który umożliwił rozwój współczesnej medycyny przyniósł ze sobą również nowe wyzwania dla organizmu człowieka. Według Światowej Organizacji Zdrowia są nimi przede wszystkim: zanieczyszczenie powietrza pyłami zawieszonymi, choroby metaboliczne oraz zaburzenia emocjonalne, prowadzące do szkodliwych dla zdrowia zachowań. Cechą charakterystyczną tych problemów jest ich przewlekłość, niezakaźność oraz brak pojedynczego czynnika patogennego, który mógłby stać się celem dla oddziaływań terapeutycznych. W związku z powyższym, klasyczny model medyczny polegający na przywracaniu organizmu do zdrowia (leczeniu) nie radzi sobie najlepiej z chorobami cywilizacyjnymi, których udział w utracie zdrowia i śmierci stale rośnie od 30 lat. Alternatywnym, bardziej obiecującym podejściem są działania prewencyjne. Ponieważ wymagają one zaangażowania jednostek do wypracowania nawyków prozdrowotnych, mogą się okazać trudne do wprowadzenia u osób najbardziej narażonych na choroby cywilizacyjne, u których zaburzenia somatyczne współwystępują z zaburzeniami afektywnymi. Stąd, przydatna byłaby forma wsparcia, która adresowałaby obie grupy problemów jednocześnie. Klasyczny model farmakologiczny „jeden związek – jeden cel biologiczny” może nie być w stanie sprostać temu zadaniu. Dlatego też, w poszukiwaniu nowych rozwiązań część badaczy i opinii publicznej zwraca się ; w kierunku natury, zaś w ostatnich latach coraz częściej – w kierunku grzybów leczniczych. Cel badań Celem niniejszej rozprawy była próba odpowiedzi na pytanie czy znany od tysięcy lat z właściwości prozdrowotnych modrzewnik lekarski jest obiecującym celem takich poszukiwań? Z uwagi na status gatunku zagrożonego wyginięciem, próby wykorzystania modrzewnika lekarskiego w prewencji chorób cywilizacyjnych muszą opierać się na materiale pozyskiwanym w warunkach kultur in vitro. Atutem tego podejścia jest możliwość wzbogacania (fortyfikacji) materiału w procesie hodowli. Dlatego drugim celem pracy było sprawdzenie jak fortyfikacja modrzewnika lekarskiego w sole cynku lub magnezu wpłynie na jego skład i właściwości. Metody Do odpowiedzi na powyższe pytania wykorzystano: 1) analizy mykochemiczne: HPLC – do oznaczenia związków organicznych, F–AAS – do oznaczenia poziomu biopierwiastków w pozyskanym materiale; 2) badania in vitro: DPPH –– do sprawdzenia aktywności antyoksydacyjnej, MTT – do oznaczenia aktywności przeciwnowotworowej w liniach komórek nowotworu płuc (A549), prostaty (DU145) oraz skóry (A375), oraz linię komórkową mysich makrofagów RAW 264.7 – do sprawdzenia wpływu materiału wobec stanu zapalnego; 3) metody biologii molekularnej: PCR i sekwencjonowanie – do potwierdzenia tożsamości gatunkowej modrzewnika lekarskiego z kultur in vitro, qRT–PCR – do pomiaru p ; oziomu ekspresji mRNA w mysich hipokampach po długotrwałej suplementacji diety liofilizatem materiału, Western Blot – do pomiaru poziomu białek w linii komórkowej mysich makrofagów RAW 264.7 oraz w hipokampach szczurów po długotrwałych podaniach 3 różnych dawek (100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg) materiału; 4) sztuczny układ trawienny Gastroel 2014 – do zbadania biodostępności związków organicznych i biopierwiastków; 5) badania in vivo: testy uniesionego labiryntu krzyżowego (EPM) oraz otwartego pola – do sprawdzenia działania przeciwlękowo–podobnego u gryzoni, test wymuszonego pływania (FST) – do zbadania strategii radzenia sobie ze stresem u szczurów, test rozpoznawania nowego obiektu (NOR) – do sprawdzenia pamięci długotrwałej myszy oraz test przerzutności uwagi (ASST) – do zbadania funkcji wykonawczych szczurów. Badania in vivo wykonane zostały na samcach myszy szczepu CD1 oraz szczurów szczepu Wistar, a zatem na szczepach outbredowych. Dieta zwierząt wzbogacana była 2 mg (myszy) lub 5 mg (szczury) liofilizatu na 1 g paszy, w celu allometrycznego dopasowania dziennej dawki do dostępnego dla ludzi preparatu z innego grzyba leczniczego – soplówki jeżowatej. Z tego względu w badaniach nad suplementacją diety, liofilizat tego gatunku wykorzystany został, jako kontrola pozytywna. Dodatkowo porównano oba gatunki do boczniaka różowego – popularnego nadrewnowego grzyba ; jadalnego, ponieważ wykazywał on podobny do modrzewnika lekarskiego profil zawartości związków indolowych i fenolowych. Wyniki W pierwszym etapie prac zoptymalizowano metodę hodowli in vitro modrzewnika lekarskiego w Pracowni Biotechnologii Grzybów Katedry i Zakładu Botaniki Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego UJ CM oraz potwierdzono tożsamość gatunkową otrzymywanego materiału. Następnie wykazano, że: 1) prekursor dla serotoniny (5–hydroksy– L–tryptofan), prekursor dla dopaminy (fenyloalanina) oraz flawonoid o właściwościach antyoksydacyjnych (katechina) występują w modrzewniku hodowanym in vitro, ale nie w owocnikach pochodzenia naturalnego; 2) modrzewnik z kultur in vitro zawiera: 2–krotnie więcej prowitaminy D2 (ergosterolu) oraz cynku, 3–krotnie więcej żelaza i nieznacznie więcej magnezu, niż owocniki pochodzenia naturalnego; 3) fortyfikacja modrzewnika siarczanami cynku lub magenzu wpływa pozytywnie na biodostępność 5–hydroksy–L–tryptofanu, natomiast fortyfikacja magnezem – na biodostępność fenyloalaniny; 4) w wyniku trawienia owocników ich aktywność antyoksydacyjna spada ~2,5–krotnie, natomiast aktywność mycelium z hodowli in vitro ~10–krotnie; 5) tylko modrzewnik z hodowli in vitro wykazywał aktywność w liniach komórkowych nowotworu płuc, natomiast owocniki były bardziej aktywne w nowotworze skóry. W kolejnym etapie zaobserwowano, że w niższych stęż ; eniach (50 µL): 1) modrzewnik lekarski podnosi poziom indukowanej cykloksygenazy (COX-2) w mysich makrofagach w porównaniu do soplówki jezowatej oraz modrzewnika fortyfikowanego cynkiem lub magnezem; oraz, 2) w wyniku fortyfikacji magnezem modrzewnik zwiększa poziom receptora TLR4. W wyższych stężeniach (100 µL): 1) modrzewnik fortyfikowany cynkiem zwiększa poziom nieindukowanej cykloksygenazy (COX-1) oraz receptora TLR4; a 2) oddziaływanie modrzewnika fortyfikowanego cynkiem na receptor TLR4 jest nasilone przy braku stanu zapalnego. W otrzymanym profilu wykazano, że mechanizm działania immunostymulującego modrzewnika lekarskiego jest modulowany przez fortyfikację oraz, że wpływ modrzewnika na odpowiedź immunologiczną jest silniejszy niż soplówki jeżowatej. W badaniach in vivo w zakresie wpływu na funkcje afektywne zaobserwowano pozytywny efekt suplementacji diety modrzewnikiem lekarskim na zachowania lękopodobne zarówno myszy, jak i szczurów w teście uniesionego labiryntu krzyżowego oraz zwiększenie zachowań eksploracyjnych/orientacyjnych w teście otwartego pola. Ponadto, w teście wymuszonego pływania modrzewnik lekarski wybiórczo zwiększał występowanie jednej z form aktywnego radzenia sobie ze stresem (pływania), kosztem drugiej z form (wspinania się), pozostając przy tym bez wpływu na bierne radzenie sobie ze stresem. Efekt ten występował przy braku wpływu na ; lokomotoryczność w teście otwartego pola, co sugeruje modulację odpowiedzi na dystres. Dodatkowo, zarówno boczniak różowy, jak i soplówka jeżowata zmniejszały bierne radzenie sobie ze stresem w stopniu analogicznym do leku przeciwdepresyjnego drugiej generacji (fluoksetyny). W zakresie wpływu na funkcje poznawcze w badaniach in vivo wykazano, że soplówka jeżowata w nieznacznym stopniu poprawia pamięć długotrwałą myszy oraz że przyrost masy ciała: 1) może mieć negatywny wpływ na tę funkcję poznawczą u zwierząt karmionych paszą kontrolną; 2) powoduje spadek ekspresji genów dla kinazy mTOR i GSK3B w mysich hipokampach niezależnie od rodzaju przyjmowanej paszy. W teście przerzutności uwagi nie zaobserwowano wpływu manipulacji eksperymentalnych, chociaż połowa szczurów suplementowanych modrzewnikiem lekarskim nie wykonała zadania wymagającego uczenia się ze wzmocnieniem. W badaniach ex vivo poziomu białek w szczurzych hipokampach wykazano: 1) spadek ufosforylowanej formy receptora dla czynników neurotroficznych (pTrkB) w wyniku suplementacji modrzewnikiem lekarskim; 2) niższy poziom białka dla czynnika transkrypcyjnego odpowiedzialnego za odpowiedź na stres oksydacyjny i neurotoksyczność (NRF2) spowodowany suplementacją soplówką jeżowatą. Wnioski Niniejsze badania sugerują, że modrzewnik lekarski pozyskiwany metodami in vitro wykazuje korzystny profil aktywności biologi ; cznej w zakresie działania przeciwnowotworowego, immunostymulującego i przeciwlękowo–podobnego, przy braku wpływu na funkcje poznawcze oraz potencjalnie niekorzystnym wpływie na motywację do uczenia się ze wzmocnieniem, który to wpływ zależny jest od różnic indywidualnych. Z uwagi na bardzo złożony skład biochemiczny, przypisanie powyższych efektów konkretnym mechanizmom wymagałoby osobnego zestawu szeroko zakrojonych badań.
Place of publishing:
Level of degree:
Degree discipline:
Degree grantor:
Rada Dyscypliny Nauki farmaceutyczne
Promoter:
Muszyńska, Bożena ; Krakowska, Agata
Date issued:
Identifier:
Call number:
Language:
Access rights:
Object collections:
Last modified:
Nov 14, 2024
In our library since:
Apr 8, 2024
Number of object content hits:
6
Number of object content views in PDF format
0
All available object's versions:
http://dl.cm-uj.krakow.pl:8080/publication/5065
Show description in RDF format:
Show description in OAI-PMH format:
| Edition name | Date |
|---|---|
| ZB-139421 | Nov 14, 2024 |
Objects
Similar
Fijałkowska, Agata
Barłowska-Trybulec, Marta
Zagórska, Agnieszka
Bugno, Ryszard
Olszak-Płachta, Marta
Satała, Grzegorz
Śniecikowska, Joanna
Czopek, Anna
