Object
Title: Badanie wpływu genu SNAI1 na proces różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do mięśni szkieletowych w kontekście rozwoju mięsaka prążkowanokomórkowego
Abstract:
Streszczenia publikacji stanowiących podstawę rozprawy: Edytowanie genomu razem z technologią interferencji RNA jest szeroko wykorzystywane w modulacji ekspresji genów przy tworzeniu modeli badawczych w badaniach nad nowotworami. Każde z tych narzędzi inżynierii genetycznej charakteryzuje unikatowy mechanizm działania. Do edycji genomu wykorzystuje się głównie system nukleaz CRISPR/Cas9 (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) oraz TALEN (ang. transcription activator-like effector nucleases). Nukleazy mają zdolność generowania precyzyjnych pęknięć dwuniciowego DNA, które w wyniku działania procesów naprawczych mogą prowadzić do inaktywacji określonego genu. Z kolei oddziaływanie interferencyjnego RNA (np. shRNA ang. short-hairpin RNA) z określonym transkryptem może skutkować obniżeniem ekspresji genu. W niniejszym artykule wykorzystano trzy różne metody modulacji ekspresji genu SNAI1 w komórkach mięsaka prążkowanokomórkowego (RMS). Celem pracy było zaprojektowanie systemów CRISPR/Cas9 oraz TALEN i porównanie efektywności ich działania z technologią shRNA w obniżaniu poziomu ekspresji SNAI1 wraz z weryfikacją uzyskanego efektu biologicznego. Po zaprojektowaniu miejsc docelowych dla CRISPR/Cas9 i TALEN, do komórek alweolarnej linii RMS RH30 wprowadzono osobno każdy z systemów oraz shRNA. Zbadano ich wpływ na sekwencję genu SNAI1 oraz po ; ziom ekspresji transkryptu i białka. W każdym z przypadków odpowiednio obniżenie lub kompletne wyłączenie ekspresji SNAI1 prowadzi do zmian morfologicznych komórek i powoduje podwyższenie poziomu ekspresji transkryptów genów związanych z miogenezą (MYOD, MYOG, MHC, MSTN i MEF2A) i tendencję do obniżenia poziomu deacetylazy HDAC1/2. Uzyskane wyniki potwierdziły skuteczność metod poprzez uzyskanie analogicznego efektu biologicznego - zoptymalizowano trzy różne metody modulacji ekspresji SNAI1 które mogą być wykorzystane w dalszych badaniach. Niemniej jednak niska wydajność edycji genomu zarówno metodą TALEN jak i CRISPR/Cas9 jest istotnym czynnikiem limitującym. Należy również zwrócić uwagę, że shRNA powoduje obniżenie poziomu SNAI1, natomiast w wyniku aktywności CRISPR/Cas9 i TALEN można uzyskać całkowite wyłączenie genu. Te techniki zostaną wykorzystane w dalszych badaniach nad rolą SNAI1 w RMS. Indukowane pluripotencjalne komórki (iPS, ang. induced pluripotent stem cells) dzięki swojej zdolności różnicowania w kierunku trzech listków zarodkowych mogą być wykorzystywane do badań procesów zachodzących podczas ludzkiego rozwoju embrionalnego, w tym miogenezy. W literaturze można znaleźć wiele protokołów opisujących różnicowanie komórek iPS w kierunku mięśni szkieletowych. Różnią się one składnikami pożywek hodowlanych, użytymi modulatorami szlaków sygnałowych, ; odpowiednikami podścieliska i czasem trwania. Celem badań była ocena i porównanie trzech różnych protokołów różnicowania komórek iPS do mięśni szkieletowych wraz ze szczegółową charakterystyką uzyskanych komórek. Dlatego komórki iPS poddano różnicowaniu do mięśni szkieletowych bazując na trzech różnych protokołach opisanych wcześniej w literaturze. Protokół I opierał się na indukcji różnicowania poprzez tworzenie ciałek embrionalnych, suplementacji ITS (ang. Insulin-Transferrin-Selenium) i selekcji na podstawie zdolności do adhezji komórek do kolagenu typu I. Protokół II również rozpoczynał się od etapu ciałek embrionalnych, ale z silnym ukierunkowaniem w stronę mięśniową na skutek dodania do medium inhibitora GSK3-β - BIO, forskoliny i bFGF (ang. basic fibroblast growth factor). Natomiast protokół III był cały czas prowadzony w monowarstwie, z zastosowaniem trzech specjalnych mediów opierających się na aktywacji szlaku WNT i inhibicji szlaków związanych z TGF-β i BMP. Weryfikacja miogennego ukierunkowania komórek była sprawdzana w każdym z protokołów na podstawie poziomu ekspresji mięśniowych czynników regulatorowych MYF5, MYOD, MYF6 i MYOG oraz markerów mięśniowych MYH3 i MYH2 w różnych punktach czasowych. Z wykorzystaniem analizy cytometrycznej zbadano ekspresję markerów powierzchniowych CD10, CD24 i CD56. Oceniono również zdolność komórek do fuzji i eks ; presji wimentyny. Uzyskane wyniki wykazały, że komórki różnicowane według protokołu III wykazują najwyższy poziom ekspresji regulatorowych czynników miogennych. Charakteryzuje je też najwyższy poziom MYH3 i MYH2. Protokół III jest najbardziej wydajny w różnicowaniu komórek iPS w kierunku komórek mięśniowych. Co więcej wykazano, że marker powierzchniowy CD56 nie jest specyficznym wyznacznikiem poziomu zróżnicowania komórek w kierunku mięśni szkieletowych. Uzyskane wyniki będą wykorzystane w dalszych badaniach nad rolą SNAI1 w miogenezie.
Place of publishing:
Level of degree:
Degree grantor:
Rada Dyscypliny Nauki medyczne
Promoter:
Majka, Marcin ; Skrzypek, Klaudia
Date issued:
Identifier:
Call number:
Language:
Access rights:
Object collections:
Last modified:
Nov 22, 2023
In our library since:
Nov 22, 2023
Number of object content hits:
0
Number of object content views in PDF format
0
All available object's versions:
http://dl.cm-uj.krakow.pl:8080/publication/4995
Show description in RDF format:
Show description in OAI-PMH format:
| Edition name | Date |
|---|---|
| ZB-137549 | Nov 22, 2023 |
Objects
Similar
Ulman, Aleksandra Ewa
Żurawski, Marek
Sułkowski, Maciej
Chlebanowska, Paula
Marcinowska, Agnieszka
Dulęba, Marcin
