Object
Title: Badania nad otrzymywaniem enancjomerów nienaturalnych aminokwasów metodą hydantoinazową
Abstract:
Metoda hydantoinazowa otrzymywania enancjomerów aminokwasów jest stosowana na skalę przemysłową od ponad 20 lat. W międzyczasie wiele zespołów badawczych na całym świecie prowadziło i prowadzi nadal szereg eksperymentów mających na celu udoskonalenie oraz poszukiwanie nowych zastosowań dla tej metody. Enzymy biorące udział w metodzie hydantoinazowej: hydantoinazę i N-karbamylazę izoluje się z nowych mikroorganizmów i bada pod kątem ich stabilności i aktywności. Prowadzone badania krystalograficzne oraz badania in vitro i in silico definiują specyficzności substratowe hydantoinaz oraz oszacowują ich enancjoselektywność. Dzięki narzędziom inżynierii genetycznej możliwa stała się ekspresja lub koekspresja genów kodujących pożądane białka enzymatyczne w bakterii Escherichia coli. W ten sposób nie tylko pozbyto się niedoskonałości związanych z ograniczoną produkcją enzymów w komórkach natywnego gospodarza ale również uzyskano możliwość prowadzenia modyfikacji i ukierunkowanej ewolucji tych enzymów w celu otrzymania funkcjonalnego białka o jak najwyższej aktywności. Stosuje się również techniki immobilizacji enzymów biorących udział w metodzie hydantoinazowej na różnych nośnikach w celu uzyskania biokatalizatorów o wyższej aktywności, stabilności oraz z przedłużonym okresem trwałości. Dodatkowo immobilizacja enzymów daje możliwość wielokrotnego ich wykorzystania. W niniejszej pracy ; przeprowadzono szereg eksperymentów mających na celu określenie specyficzności substratowej dwóch D-hydantoinaz: immobilizowanej, rekombinowanej w bakterii E. coli (rD-Hyd), oraz wyizolowanej z rośliny Vigna angularis z gatunku fasolowatych (V.a.D-Hyd). Do badań zsyntetyzowano 21 substratów dla reakcji enzymatycznych prowadzonych przez D-hydantoinazy – pochodnych (R,S) 5-benzylohydantoiny. Spośród otrzymanych struktur tylko (R,S) 5-benzylohydantoina została jak dotąd opisana w literaturze jako związek wydajnie i enancjoselektywnie biotransformowany do D-fenyloalaniny metodą hydantoinazową. Dzięki zastosowaniu elektroforezy kapilarnej CE do monitorowania procesów biotransformacji obliczono i porównano ze sobą stałe szybkości reakcji k prowadzonych reakcji enzymatycznych oraz okresy połowicznego rozkładu badanych pochodnych (R,S) 5-benzylohydantoiny t0,5. Na wybranych przykładach obliczono i porównano ze sobą również stałe szybkości reakcji oraz okres połowicznego rozkładu badanych substratów w różnych wartościach pH środowiska reakcji. Produkty reakcji biokatalizowanych przez enzym rD-Hyd przekształcono w reakcji diazowania w odpowiednie D-aminokwasy a następnie przeprowadzono analizę chromatograficzną HPLC tych związków na kolumnie ChiroSil (RCA+) z chiralną fazą stałą w postaci modyfikowanych eterów koronowych. Oszacowano w ten sposób nadmiar enancjomeryczny (%ee) otrzym ; anych aminokwasów a w konsekwencji po raz pierwszy określono enancjoselektywność enzymu rD-Hyd wobec pochodnych (R,S) 5-benzylohydantoiny. Na kilku wybranych D-aminokwasach opracowano metodykę analizy nadmiaru enancjomerycznego (%ee) przy użyciu elektroforezy kapilarnej CE stosując sulfonowane α-cyklodekstryny (HS-α-CD) pełniące rolę chiralnych selektorów w procesie enancjoseparacji. W oparciu o dane literaturowe wytypowano spośród otrzymanych metodą hydantoinazową pochodnych karboksylowych i alkoksylowych D-fenyloalaniny kilka związków o potencjalnym działaniu na receptory glutaminergiczne. Otrzymane związki oczyszczono przy pomocy żywicy jonowymiennej Amberlite 120 H+ i wyizolowano z roztworu w procesie liofilizacji. Następnie przekazano do wstępnych badań farmakologicznych. W kolejnym etapie badań otrzymano w bakterii Escherichia coli rekombinowany enzym N-karbamylazę (rN-Kar). Rekombinowane szczepy bakterii otrzymano po wprowadzeniu do komórek wektora plazmidowego pAH71 zawierającego sekwencję genu N-karbamylazy. W kolejnym etapie zaindukowano ekspresję genu przy pomocy induktora IPTG i potwierdzono ekspresję rekombinowanego białka metodą elektroforezy żelowej białek SDS-PAGE. Po przeprowadzeniu biotransformacji otrzymanych wcześniej N-karbamylo-D-aminokwasów przy użyciu zaindukowanych szczepów bakteryjnych wykazano funkcjonalność rekombinowanego enzymu. Reakcje te monit ; orowano metodą elektroforezy kapilarnej CE. Elektroforezę kapilarną CE zastosowano również do rozdziału DNA wektora plazmidowego pAH71 przed i po przeprowadzeniu reakcji trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi. Wyniki rozdziałów porównano następnie z rozdziałem DNA klasyczną metodą w żelu agarozowym oraz z danymi literaturowymi.
Place of publishing:
Level of degree:
Degree discipline:
Degree grantor:
Promoter:
Date issued:
Identifier:
Call number:
Language:
Access rights:
Object collections:
Last modified:
Mar 15, 2023
In our library since:
Jun 24, 2022
Number of object content hits:
0
Number of object content views in PDF format
0
All available object's versions:
http://dl.cm-uj.krakow.pl:8080/publication/4757
Show description in RDF format:
Show description in OAI-PMH format:
| Edition name | Date |
|---|---|
| ZB-114722 | Mar 15, 2023 |
Objects
Similar
Latacz, Gniewomir
Gonciarz-Dytman, Anna
Bajda, Marek
Godyń, Justyna
